Cercetarea genetică modernă a intrat într-o eră transformativă determinată de dezvoltarea de instrumente de inginerie genetică de precizie. Printre tehnologiile de pionierat, TALENs (Transcription Activator-Like Effector Nucleasses) și ZFNs (Zinc Finger Nuclessings) se remarcă ca platforme de fundație care au permis modificarea țintită a ADN-ului cu mult înainte de revoluția CRISPR. Aceste proteine create permit oamenilor de știință să introducă pauze duble în locații genomice definite, pârghiind calea de reparare înnăscută a celulei (NHEJ) sau reparații cu orientare omonimă (HDR) pentru a realiza knockout-ul genei, corecția sau inserția. Influența lor se extinde peste medicină, agricultură și cercetare biologică fundamentală și rămân indispensabile în aplicații în care sunt necesare secvențe de mare specificitate sau mici ținte.

Înțelegerea mecanismelor TALEN și ZFN-urilor

Nuclease-uri pentru degetul de zinc: recunoaşterea ADN-ului modular

ZFN-urile au fost primele nuclee programabile, adoptate pe scară largă, descrise mai întâi la mijlocul anilor '90. Fiecare ZFN cuprinde un domeniu de legare a ADN-ului asamblat din proteine din degetul de zinc și un domeniu de bază ADN derivat din FokI restriction endonuclease. Modulele individuale de degetul zinc recunosc de obicei o secvență de trei nucleotide. Prin conectarea mai multor degete din tandem, cercetătorii pot viza secvențe variind de la 9 la 18 perechi de bază. Deoarece FokI trebuie să se dimerizeze pentru a tăia ADN-ul, două ZFN-uri sunt concepute pentru a lega brațe opuse ale site-ului țintă, poziționate astfel încât domeniile lor de decolare să se reunească peste o regiune a spațiului spațial. Această cerință pentru heterodimerizare reduce semnificativ activitatea de pe țintă.

Proiectarea și asamblarea de array-uri de degetul zinc poate fi dificil din punct de vedere tehnic, datorită afinități-context dependent de zinc degete recunoașterea poate fi influențată de degetele adiacente. Cu toate acestea, metode cum ar fi OPEN (Oligomerized Pool Engineering) și ansamblu dependent de context au îmbunătățit previzibilitatea. ZFN-urile au fost utilizate pentru a crea linii celulare knockout, genera modele animale transgenice, și mutații corecte de cauzare a bolilor în studiile clinice timpurii.

Transcriere Activator-Like Effector Nucleases: Specificitatea unui singur nuclerotide

TALENs a apărut în jurul anului 2009 . Ca alternativă cu reguli de proiectare mai simple. Domeniul lor de legare de ADN vine de la efectori de tip transcriptie (ALE), proteine secretate de agentul patogen al plantelor Xanthomonas[.Fiecare modul TALE recunoaște exact o nucleotidă, determinată de două reziduuri de aminoacizi hipervariabile, cunoscute ca variabila repetată di (RVD). Cele mai comune perechi de RVD . Este NI pentru adenină, HD pentru citozină, NG pentru timină și NN pentru guanină (sau NK pentru specificitate mai mare). Prin organizarea acestor module în ordine, un TALEN poate viza practic orice secvență ADN.

TALEN folosesc şi domeniul de clivaj FokI[ şi necesită legare asociată pentru tăiere. Ansamblul de array-uri repetitive TALE poate fi realizat folosind clonarea Golden Gate sau sinteza de fază solidă. TALEN-urile prezintă în general o specificitate mai mare decât ZFN-urile şi toxicitate mai scăzută în celule, deşi mărimea lor mare (~3 kb per monomer) poate fi o limitare pentru livrarea vectorului viral. Cu toate acestea, ele au fost aplicate cu succes în cadrul unor studii preclinice de terapie genetică, în care se pot efectua studii de laborator.

Dezvoltarea istorică și obiectivele de etapă

Călătoria nucleelor proiectate a început cu descoperirea proteinelor din degetul zincului la sfârşitul anilor 1980. În 1996, Chandrasegaran şi colegii au fuzionat un domeniu cu trei degete de 10 x x x x x [[ ]FokI[, creând prima proteină ZFN. Această descoperire a permis editarea genomului vizat în [Drosophila[] şi ulterior în celulele umane. Până în 2005, ZFN-urile au fost folosite pentru a modifica CCR5 genă pentru a conferi rezistenţă HIV, un concept care ulterior a intrat în studiile clinice. Studiul SB‐728-T (Sangamo Terrapics) a utilizat ZFN-uri pentru a perturba CCR5[[FLT:] la pacienţi celulele T, demonstrând siguranţa şi enflansare pe termen lung.

Tehnologia TALEN s-a dezvoltat rapid după elucidarea structurală a proteinelor TALE în 2007. În trei ani, mai multe grupuri au raportat TALEN funcționale pentru editarea genelor în drojdie, plante și celule umane. Simplitatea lor a coborât bariera pentru laboratoarele academice de a adopta editarea genomului, declanșând un val de descoperire. Până în 2012, TALEN au fost folosite pentru a crea primii porci genetici cu ediție genetică pentru modelarea bolilor și cercetarea xenotransplantării. Revizuirea cuprinzătoare de către Kim și Kim (2014) în ]Nature Reviews Genetics detaliază evoluția paralelă a ambelor tehnologii.

Aplicaţii în Cercetarea Modernă

Cercetare medicală și terapie genică

ZFN şi TALEN au terapie genetică avansată pentru tulburări monogene. În cazul anemiei cu celule falciforme şi beta-talasemiei, ZFN-urile care vizează BCL11A[ potenţatorii eritroide reactivează expresia hemoglobinei fetale. Un studiu clinic de fază 1/2 (NCT03282656) utilizând ZFN-uri pentru a edita celule stem hemopoetice ex vivo a demonstrat o îmbunătăţire susţinută a hemoglobinei. TALEN-urile au fost utilizate pentru corectarea expresiei ]IL2RG genă în celulele cu imunodeficienţă combinată X-legată (SCID-X1), cu celule corectate care prezintă reconstituire funcţională a modelelor de şoarece. În oncologie, ambele nucleaze au fost utilizate pentru a iniţia oncologie receptorul de antigen chimeric (CAR) -T cu persistenţă îmbunătăţită şi epuizare redusă.

Biotehnologie agricolă

În ameliorarea culturilor, TALEN și ZFN au fost utilizate pentru a crea soiuri rezistente la erbicide și la boli. Prima calitate de calitate a boabelor de cultură cu conținut redus de TALEN cu profil petrolier îmbunătățit a fost dezvoltată de Calyxt și eliberată în 2019. ZFN-urile au fost aplicate pentru a crește randamentul orezului prin eliminarea regulatorilor negativi de dimensiune a cerealelor. Specificitatea ridicată a acestor nucleaze reduce modificările genomice nedorite, care sunt avantajoase pentru acceptarea în scopuri de reglementare. O analiză detaliată efectuată de Joung și Sander (2013) în ]Nature Biotechnology evaluează aplicarea TALEN în ingineria genomului vegetal.

Genomie funcțională și organisme-model

Ambele platforme au permis studii sistematice de knockout gena la specii în care celulele stem embrionare nu au fost disponibile. În zebra, TALEN au fost folosite pentru a crea >200 mutanți vizate într-un singur efort de consorțiu, dezvăluind funcțiile genetice în dezvoltare și boală. La șobolani, ZFN-urile au perturbat p53 tumorii suprimate pentru a crea modele de cancer. Capacitatea de a genera mutații precise prin HDR folosind donatori de oligonucleotide mono-strandați a extins repertoriul modelelor knock-in pentru boli neurodegenerative și cardiovasculare. Cercetătorii au combinat, de asemenea, TALEN cu sisteme de expresie condiționale pentru a realiza editarea specifică tisulară.

Punctele forte si limitele in comparatie cu CRISPR-Cas9

Aparitia CRISPR-Cas9 (2012) a oferit un design mai simplu, capacitate de multiplexare si eficienta mai mare, care sa conduca la adoptarea sa pe scară largă. Cu toate acestea, TALEN si ZFN-urile isi pastreze avantaje unice.Recunoasterea ADN-ului lor bazat pe proteine nu se bazeaza pe un ARN ghid, eliminând riscul efectelor off-tintale mediate de ARN.In plus, ZFN-urile si TALEN-urile prezinta specificitate mai mare pentru secvente cu regiuni repetitive sau bogate in GC-care contesta tinta CRISPR. Marimea mai mare a acestor constructii (~4 2012/10 kb) poate fi ambalata in vectori ai virusului adeno-asociat (AAV) cu dificultate, dar strategiile dual-vector si modelele mini-TALEN sunt optimizate.

O limitare majoră este costul și munca necesară pentru ingineri noi ZFN sau TALEN pentru fiecare țintă. În timp ce CRISPR necesită doar reproiectarea unei secvențe de ghidaj de 20-bp, sinteza ZFN și TALEN necesită asamblarea și validarea domeniului proteic. Decolteu off-țintă este, de asemenea, o preocupare; array-uri de degetul zinc poate tolera neconcordanțe, iar TALEN-urile pot tăia în locuri țintă parțiale. Profilarea cuprinzătoare off-țintă folosind metode cum ar fi Ghid-Seq sau CIRCLE-Seq este esențială pentru traducerea clinică. ]A 2017 revizuire în ]Trends în biotehnologie contrastează profilurile de fidelitate și livrare ale acestor trei nucleaze.

Direcţii viitoare şi îmbunătăţiri continue

Cercetarea actuală are ca scop stimularea eficienței și siguranței TALEN-urilor și ZFN-urilor în timp ce reduc costurile de producție. Progresele în ingineria proteinelor au generat ZFN-uri cu termostabilitate îmbunătățită și citotoxicitate redusă. Reproiectarea ghidată de structură a FOKI variante (cum ar fi ELD-KKKR și Sharkey) îmbunătățește specificitatea dimerizării și activitatea catalitică. Pentru TALEN-uri, algoritmii de învățare automată prezic acum combinații optime pentru țintele RVD și clonarea porții aurii de aur cu grad înalt de throught permite fabricarea matricei într-o singură zi.

Livrarea rămâne un blocaj pentru aplicaţii in vivo. nanoparticulele de lipide şi vectorii virali asociaţi adeno-asociaţi sunt perfecţionaţi pentru celulele stem şi hepatocitele hematopoietice. Livrarea tranzitorie a proteinelor ZFN/TALEN (mai degrabă decât ADN) reduce expresia nucleazei prelungite şi evenimentele off-ţintă. În agricultură, TALEN sunt folosite pentru a dezvolta culturi cisgenice care introduc alele naturale fără ADN străin. Peisajul de reglementare poate favoriza aceste instrumente pre-CRISPR datorită antecedentelor lor de siguranţă stabilite şi a precediante pentru aprobarea pieţei.

În cele din urmă, combinația TALEN sau ZFN cu editarea bazei sau editarea primară a tehnologiilor care se bazează pe nickase-uri, mai degrabă decât pe pauze duble. De exemplu, o citidină deaminază cu degetul-Zn poate efectua conversia de bază orientată fără pauze duble. Cercetul clinic publicat pe baza ZFN CCR5] editare (Tebas et al., 2014, New England Journal of Medicine]]] ilustrează potențialul terapeutic care continuă să conducă investiții în aceste platforme clasice.

În concluzie, TALEN şi ZFN-urile rămân vitale în setul de instrumente de cercetare genetică. Proprietăţile lor distincte de recunoaştere ADN-ului modulară, specificitate ridicată şi siguranţă stabilită fac ca acestea să nu poată fi înlocuite pentru anumite aplicaţii, mai ales atunci când instrumentele bazate pe ARN sunt necorespunzătoare. Pe măsură ce câmpul se îndreaptă spre medicina de precizie şi agricultura durabilă, aceste nucleaze pioniere vor continua să catalizeze descoperiri care îmbunătăţesc sănătatea umană şi securitatea alimentară.