磁带细胞分离介绍

细胞分离是现代生物学和医学中的基石技术,它使研究人员能够将特定细胞群与不同的混合物隔离,用于下游分析、培养或治疗。 在各种分离技术中,磁珠方法由于速度、简单度和温和处理的结合而得到广泛采用。 这些方法依赖于超等磁珠功能化,与靶细胞表面标记结合,从而能够在磁场下实现高效隔离。 在过去20年中,磁分离从一个优势实验室工具发展成为了基础研究、临床诊断和细胞治疗制造中所使用的标准技术。

磁带的基本原理

磁珠一般是直径从纳米至微米不等的球状颗粒,由聚合物或硅基质组成,由磁纳米粒子(通常为氧化铁、Fe]3]]O4]2]]O3])组成。 关键属性是超极磁性:当磁珠暴露于外部磁场,并且没有留下残余磁性,这种行为防止了未预期的聚合,允许分离后再悬浮。 珠表面通常涂有功能组(例如:碳酰胺、矿、石整质维丁),用于生物分子的共价耦合,最常见的单克隆抗体针对细胞表面抗原,如CD4、CD8、CD34或EPCAM的特性。

磁细胞分离原则

分离过程可以分为两种主要方法:正选和负(耗尽)选择. 在正选中,珠子被结合到能识别靶细胞群的抗体上. 孵化后,受珠子束缚的细胞被磁场捕获,而无约束的细胞被丢弃. 在负选中,受珠子束缚的无理想细胞被磁性切除,使靶细胞不受珠子的影响. 后一种方法在靶细胞稀有,脆弱,或不能被贴标签进行功能研究时更受青睐.

磁分离步骤

  1. 样板制备: 组织分解,梯度离心,或红血球的解析,以获得单细胞悬浮. 滤泡通过30–40微米网膜经常被进行去除结膜.
  2. 与磁珠的孵化:[ 细胞悬浮与预定数量的珠-抗体交集物混合,孵化条件(时间,温度,激发)被优化,以最大限度地结合,同时尽量减少非特定粘合.
  3. 磁性捕捉: 混合物被置于磁场中(使用柱状、管状或板状形式的永久磁体)。带球的细胞向磁体迁移,而无带球的细胞则被冲走。
  4. Wash steps: 多个用缓冲器洗涤(通常PBS用0.5%的BSA和2 mM EDTA)去除污染无约束细胞和残留珠.
  5. 恢复:[ 对于正选,可以将所捕获的细胞去除磁,并重置球体,从而省略。或者,可以直接将细胞用在磁体上进行后续的化验。

磁分离系统的类型

有几个商业平台,每个平台都因不同吞吐量和自动化水平而得到优化。

  • 以胶片为基础的系统(例如Miltenyi Biotec MACS): 细胞通过一个放置在强磁场中的钢羊毛柱,带标的细胞被保留,而无标的细胞流经。柱被冲洗后从磁铁中去除,以提升绑定的分数。这个系统可以处理大细胞数(最高109),并实现高纯度。
  • 以立方体或板状系统(如Dynabeads,StemSep): 与珠混合的细胞被放置在磁铁附近的管或微板上,珠状细胞被拉到侧或底部,超纳特被移除,这种方法简单快捷,但可能具有较低的吞吐量.
  • Microfluidic 设备:新兴技术使用集成磁体或磁场梯度的微通道在单细胞层面分离细胞,这些技术对于稀有细胞隔离很有希望,但还没有成为主流.

传统方法的优点

与流体细胞测量分拣(FACS)或密度梯度离心相比,磁珠分离提供了若干优点:

  • 标注: 典型协议需要30–60分钟,而FACS的时数则比较,使其适合同时处理多个样品.
  • 伸缩性: 从105到1010细胞可以一次处理,视系统而定,这对于临床规模的细胞疗法至关重要.
  • 简单: 不昂贵的仪器(仅需要磁铁)和最低限度的操作员训练,协议是直截了当的,可以复制的.
  • 枪管处理:[ 剪力低,细胞不受高压或电场的冲击,可活性一般超过90%.
  • 维度:适用于多种细胞类型,包括主细胞,干细胞,细菌,甚至次细胞器官. 贝也可以功能化用于蛋白质或核酸捕捉.

考虑因素和限制

尽管磁珠分离有其好处,但磁珠分离有其警告。 珠子分离必须被考虑在珠子可能干扰的应用中,比如功能测定或移植中去除。有些系统允许酶或机械珠分解,但这会影响细胞生存能力或标记表达。此外,珠子与细胞表面抗原的结合可能会引发信号或激活,改变细胞行为。对于负面选择,耗尽效率必须用流细胞测量法来确认。 最后,成本对于大规模研究来说可能很大,尽管许多协议允许对有限的周期重新使用珠子。

研究和医学应用

磁细胞分离在生物医学中得到广泛应用。

免疫学

T细胞子集(如CD4+,CD8+),B细胞,自然杀手细胞,凹槽细胞,以及单细胞进行功能分析,细胞基质剖析,或收养转移实验的隔离. 消极选择是未激活的T细胞的首选,以避免激活.

癌症研究

利用抗EpCAM或抗HER2珠子,使血液中循环肿瘤细胞(CTCs)富集,从而可以对肿瘤的进化和治疗反应进行非侵入性监测。 同样,癌症干细胞也可以基于CD44/CD24表达法得到富集。

化粪池生物学

从骨髓中积极选择肝脏干细胞(CD34+)或调动外围血液进行移植. Mesenchymal干细胞(MSC)经常通过消极选择被隔离,以去除不想要的细胞.

生殖医学

细胞疗法制造依赖于磁分离来净化治疗细胞群在注入前,例如,用于CAR-T疗法的T细胞在基因改变前被磁珠隔离.

微生物学

带有细菌或病毒抗原特异性抗体的磁珠可以检测或分离复杂样品的病原体,用于食品安全和临床诊断。

未来方向和创新

该领域继续发展。

  • 多参数分离:[] 使用大小/磁性不同的数个珠型同时隔离多个种群.
  • 自动和微流体:[ 与液处理机器人进行集成,用于高通量,低容量的样品处理.
  • 改进的珠子设计: 内化后降解的可生物降解珠,或可用于细胞内送药的纳米级珠.
  • 与其他技术的结合:[] 超纯量人群先用磁珠浓缩,然后用FACS进行。

随着磁珠技术的成熟,它有可能成为个性化药物和细胞疗法的更不可分割的部分.

结论

磁珠细胞分离改变了研究人员从复杂的混合物中分离和净化特定细胞类型的方式。 磁珠细胞结合速度、简单和温和的处理,是基础研究和临床应用中不可或缺的工具。 理解原理、选择适当的系统以及优化协议对于获得高纯度、可行的细胞至关重要。 持续的发展保证了更大的功能和整合,确保磁珠分离在未来几年中仍然是一项基石技术。

进一步读作: Miltenyi et al. – 磁细胞分离(自然生物技术), 细胞隔离中的磁珠审查(免疫方法杂志], 希格玛-阿尔德里奇磁珠技术指南。