理解软骨细胞文化的挑战

软骨细胞因具有独特的结构和生物化学特性,在初级细胞培养中,这种基质不仅抵抗酶消化,而且还限制营养的传播,使细胞恢复和随后的增殖成为一项重大挑战。骨骼是血管,含有大量血栓细胞外基质(ECM)中嵌入的缺血细胞。 细胞内含有富含二型碳、蛋白质和蛋白质的细胞质。这种基质不仅能抵抗酶消化,而且能限制营养的传播,使细胞恢复和随后的增殖成为一项重大挑战。骨骼是一种由血栓体沉积的血栓细胞组成的矿化组织。磷酸钙晶体的存在需要解析步骤,如果不加以仔细控制,则会损害细胞的存活能力。此外,这两种组织都表现出低细胞密度(血栓细胞占软骨体体体积的5%以下,骨骼中同样稀缺),这意味着每个可行的细胞恢复都是宝贵的。 脑膜退化、手术创伤和病人年龄隔离进一步影响细胞的内在体内培养。

成功隔离细胞和文化战略

酶消化

细胞与密集连接组织隔离的基石是酶消化。 凝胶酶(I型、II型或混合体)是使用最广泛的酶,因为它降解了原生的细胞细胞纤维,释放了被嵌入的细胞。对于软骨来说,两步消化往往产生更好的可行性:首先,用三联素或先质去除表面蛋白质,然后用高血糖进行长时间的孵化(4-18小时),用高血糖酶进行低浓度(0.1–0.2% w/v)进行长期消化。对于骨骼,使用氯酸酶和脱脂(中性亲缘)结合,既可以消化细胞又可以消化出细胞细胞,对于优化酶的浓度和消化时间至关重要;过度的酶活性或过长的消化可以使细胞或消化细胞表面受体,降低附着效率。对于消化过程中的基因和定期的三联作用,通过70微粒或解膜的消化,细胞通过解,通过解和解膜膜。

骨质解码

在酶消化前,骨组织必须去解析以软化矿物基质。两种主要方法是切除剂(如EDTA)和酸(如盐酸或硫酸 ) 。在中性pH中,EDTA更适合要求高细胞生存能力的研究,因为它能分解钙离子而不破坏细胞蛋白。典型的协议是,在4°C时,在0.5 M EDTA(pH 7.4)中,每天改变溶液。酸解速度更快,但更具有攻击性;在细胞存活能力较弱的地方,它往往被保留用于肝脏分析。在解析后,软化组织会彻底洗涤除,然后用标准的酶消化处理。研究人员应该通过测试辐射透明度或机械柔性来监测终点,以避免过度解毒,因为它可以将卵细胞分解。

机械分离和微分解

对于很小的生物检查或者当酶消化不切实际时,可以使用机械方法. 立体显微镜下的微分解可以精确隔离软骨刮切或曲棍球骨片,最大限度地减少周围组织的污染. 之后用手术刀切除后会产生细小的外植,可以直接放入培养盘(植株培养)中,虽然这在最初产生较少的细胞,但是从植株边缘产生的细胞分泌量在7~14天之间可能相当大. 机械脱节还可以与酶治疗相结合,改善细胞的恢复,特别是纤维化或生长板软骨.

生长因子和信号分子的使用

光细胞和骨质固醇一旦分离,就需要增加特定的生长因子来扩散和维持其苯基。骨质固醇蛋白(BMP ⁇ 2,BMP ⁇ 7)和转化生长因子(TGF ⁇ 1和TGF ⁇ 3)对于促进光子生成和骨质固醇至关重要。纤维固醇生长因子(FGF ⁇ 2)和胰岛素生长因子(Isulinlike Growth Project ⁇ I)常常是支持基质矿化的标准成分。典型的浓度范围为1-50纳克/毫升,以及添加的时机;例如,在早期扩张后,TGF ⁇ 在防止高营养后通常会撤销。 对于骨质固醇,脱氧二甲酮(10-100纳米),作为复方酸(50微克/毫升),β-glycrophate (10毫升),是支持基质矿化的标准成分。 Serum(10%胎体固醇)为非定活性复素研究提供了一种非增生素,但使用率越来越是确定。

优化文化媒体和补充

细胞培养介质选择会直接影响细胞行为。 对于细胞细胞,高葡萄糖Dulbecco的经改鹰介质(DMEM)辅以GlutaMAX,非必需氨基酸,HEPES缓冲物很常见。在XMEM或DMEM中,骨骼生长,如果以后要诱导矿化,钙含量会降低。血清浓度和批量一致性至关重要;一些实验室使用20%的血清来改善低产样本的附着性。 在初始隔离期间,添加了抗生素(penicillin ⁇ streptomycin)和抗虫素(amphotericin B),但一旦培养出来以减少细胞毒性,就应当进行粘贴。 视觉监测时会包括pH指标(酚红色),但对于敏感的实验,建议使用苯酚-红 ⁇ 无配方来避免产生异性效应。

3D 文化系统与脚手架

双维单层培养可导致光细胞脱异(丧失焦炭二和卵巢表达)和骨质减压。三维系统最好模仿本地的微观环境。Pellet培养(离心细胞聚合物)、微质培养和水凝胶封装(甘糖、白素、焦炭或硫酸)经常用于维持苯基,采用循环压缩或液态剪切压力的生物反应器可进一步加强基质生产和细胞对接。对于用氢亚帕底物、磷酸 ⁇ 或脱矿化骨基质制成的骨骼、多孔体的骨骼,可提供结构支持和骨导指示器。这些先进的培养模型对于研究机械生物学和开发组织工程草至关重要。

隔离牢房的质量控制和特性

隔离和培养后,必须验证细胞特性和纯度。对于胆囊来说,阳性标记包括II型、巨噬细胞、SOX9和软骨寡糖基质蛋白(COMP)。骨质标记包括Runx2、卵巢、碱性磷酸盐和骨质钙。流体测量、定量PCR和免疫素是标准方法。在每次通过之后,应重新评估活性;下降至70%以下表明压力。血氧碱基质在长时间扩张期间可以监测染色体稳定性。此外,功能测定(如血囊中的白血球素的白质素、血囊中的白质素或血囊中的白质素红质素)证实细胞保留其特殊功能。

常见的陷阱和麻烦的解决

通常会出现一些问题,例如:从软骨和骨骼中培育细胞。 ] 低温细胞的生成可通过延长消化时间(在安全限度内)、使用新鲜酶或结合酶和外植方法来解决。 细菌或真菌污染是一种持续的威胁,特别是在与外科试样合作时;在加工前彻底清洗含有3×抗生素的无菌PBS,以降低风险。 分化 胆囊细胞的分化往往通过从多边形向纤维状形态的转变来表示;使用低度通道细胞(P0或P1)、无血清液或低血清质条件与生长因素相结合,3D培养可以减缓这一过程。 Poor附着物可由甲状腺基表面、无菌素、或多晶体状细胞质的分解控制[1] 矿基的分解、固态和矿基的分解。

未来方向和新兴技术

最近的进展正在推动从骨骼组织中稀缺细胞群所能达到的目标的界限。单细胞RNA测序揭示出心细胞和骨细胞间出乎意料的异质性,从而能够有更有针对性的培养策略。有机体和微组织模型正在开发中,将多种细胞类型(胆细胞、骨质细胞、内皮细胞)结合起来,研究骨质炎和骨修复。微流体平台允许骨骼和软骨外科的渗透培养,维持了数周的可行性。基因编辑工具,如CRISPRXCas9,可以引入初级细胞,研究基因功能或纠正疾病突变。此外,诱发的多产性干细胞正被定向于心细胞和骨质细胞,为研究和治疗提供了无限的细胞来源。这些创新有望克服细胞培养中许多来自挑战组织固有的局限性。

结论

成功地从软骨和骨骼培育细胞需要多面体方法,尊重这些组织的独特生物学。仔细选择酶消化规程、解析方法、生长因子鸡尾酒和培养平台,将大大提高细胞产量和肝脏稳定性。严格质量控制确保下游应用中使用的细胞是真实和实用的。通过采用这些战略,研究人员可以释放骨细胞模型的潜力,促进再生医学、药物测试和对肌肉骨骼疾病的基本理解。在3D文化、有机体-O-O-O-Chip系统和干细胞技术方面不断创新,将进一步扩大我们研究这些具有挑战性但具有生命力的组织(Curr. Osteoporos. Rep. 。

关于酶消化的详细协议,见 自然协议[集;生长因子准则,见 变质细胞翻译医学[];关于解析技术,见 普美德指数化方法[].