超临界流体色谱学(SFC)已成为分析化学中一种强大多用途的技术,特别是用于分析复杂的脂质和脂肪酸。 在过去十年中,仪器、柱子技术和检测方面的创新将SFC从一种特殊方法推向了脂质组学、食品质量控制和生物药理学特征化的主流工具。 它能够将非挥发性、热性、利体和结构多样性的脂质物种分离,使其具有高速和低溶剂消耗,成为气相色谱学(GC)和液态色谱学(LC)的有吸引力的替代品。 本条回顾了SFC在脂质和脂肪酸分析方面的基本原则、最新技术突破、实用应用以及未来方向。

超临界流体色谱学基础

全氟化碳使用一种超临界流体——最常见的是二氧化碳(CO2]——作为移动相。超临界流体(31.1 °C)和压力(73.8 bar)、CO进入一个具有气体粘度和疏松性,与液体的溶解力相结合的状态。这种独特的组合能够使分析器迅速进行质量转移和高效分离,并具有广泛的极性。超临界流体2的溶解强度可以通过调整压力和温度,以及增加极性调剂,如甲醇、乙醇或异丙醇等,来调节。通常采用模梯度来提高更极性脂类,包括磷脂和苯基。现代全氟化碳系统在600巴和温度以下的压下运行,为方法开发提供宽的操作窗口。

最近的技术进展

高分辨率质量光谱测量(HRMS)

将SFC与高分辨率质谱法结合起来——如四极座飞行(QQTOF)和轨道喷射仪——使脂质特征分析发生了革命性的变化。HRMS提供了精确的质量测量(<1 ppm) that enable confident identification of lipid species and their regioisomers. For example, SFC‑MS/MS workflows can distinguish between sn)1和sn2]3 脂肪酸在三联苯甲酸中的位置,这是营养和代谢研究的迫切需要。最近的研究《日记》A,展示了SFCXTOF在30分钟内对15个阶层的未定标脂质生物群的应用。

高级站台相和列化学

柱状技术已大大发展,以解决复杂的脂类混合物分离问题。常规的光硅或C18阶段正由有针对性地选择脂类分离的保质阶段加以补充。例如,2 ⁇ 乙二醇(2 ⁇ EP)、二醇和丙基 ⁇ cyano阶段为磷脂、甘油脂和中性脂类提供了正交选择性。亚 ⁇ 2 ⁇ m完全多孔的颗粒和表面多孔的颗粒在保持中度后压的同时,能提供高效率。一个显著的创新是开发了 ul ⁇ -性能趋同色谱法(UPC2],该谱法使用亚 ⁇ 2 ⁇ m颗粒,并在超高压下运行,以实现与UHPLC相当的分离速度。

自动化和高额平台

现代SFC系统包括能够处理许多样本的自动取样器、精确的后压调节器(BPR)和多轴分析的柱式切换阀。这些特性使得大规模组群研究或常规质量控制所必需的高通量工作流程成为可能。微型SFC系统有时被称为毛细管或微小SFC,它每跑一次可以将溶剂消耗量降低到微升器,并允许与纳米SQESIMS结合以提高敏感性。自动化方法开发软件可以快速优化变质梯度、温度和压力,现在可以融入商业平台,将方法设置从几天缩短到小时。

利皮德和脂肪酸分析中的应用

利皮组学和生物标志发现

非目标脂质组学旨在全面剖析生物基质中的脂质物种. SFC ⁇ MS在这里表现突出,因为它能在单径的广极范围内分离脂质. 在一项划时代的研究中,Bamba et al.]分析化学[]中,应用SFC ⁇ MS来剖析哺乳动物血清中的脂质,涵盖自由脂肪酸、磷脂质和可复制性高的三联血清醇,现在采用这一技术来发现2型糖尿病、非α-碳脂肝脏疾病和某些癌症等疾病的脂质生物标志,例如,用SFC ⁇ MS工作流程在血浆中发现了早患色癌的患者的血清中经过改变的淋巴酰胆碱和细胞素特征。

食品质量和认证控制

脂肪酸成分是食用油、乳制品和加工食品中营养价值和储存寿命的关键决定因素。与传统的GC方法相比,SFC对脂肪酸甲基酯(FAMEs)进行了更快的分析,运行时间往往不到10分钟。此外,SFC可以直接分析自由脂肪酸和乙酰甘油,而不产生衍生物,简化样品的制备。最近的工作是SFC-UV,将鱼油胶囊中的omega ⁇ 3和omega ⁇ 6脂肪酸量化,实现低于2%的相对标准偏差。该技术还用于通过对三联甘油的指纹进行特征分析,检测昂贵油(如橄榄油)的掺杂情况。

临床和诊断应用

在临床实验室,SFC正在获得与新陈代谢和心血管风险的生来错误有关的脂肪酸和脂质定量的牵引力. 等离子体自由脂肪酸(FFA)剖面被测量以评估胰岛素耐受性和糖尿病并发症. SFC ⁇ MS允许同时测定FFA,羟基 ⁇ 和氧脂素,它们是生物活性脂质调节剂. 最近的一篇在Talanta中报道了人类血浆中20个氧脂素的SFC ⁇ MS/MS方法,其检测极限低于0.1纳克/毫升,从而能够在临床研究中进行强量化.

利皮代谢和植物生物化学

了解植物、藻类和微生物中的脂质生物合成对于生物燃料生产和营养改善十分重要。 SFC ⁇ MS能够快速分析膜脂、储存脂质及其前体。 研究人员利用SFC来描述不同生长条件下微藻中的甘油脂和磷脂,揭示营养素压力如何改变脂质积累,而这是优化藻类生物柴油产量的关键信息。

与传统方法的比较

与气相色谱法(GC)相比,SFC避免了非挥发性脂类的衍生需要,保留了热性脂类化合物(如多倍键的多不饱和脂肪酸,氧化脂类),并采用了较低的操作温度,然而,GC仍然为简单的FAME提供了优越的解析度,并且仍然是许多监管环境下脂肪酸成分的参考方法. SFC可以分析完好无损的三聚氰基甲酸和极性脂类,而GC无法进入.

相对于液相色谱法(LC,特别是逆相),SFC提供更快的分析时间(典型的为5–15分钟对脂质胺LC运行20–60分钟),使用较少的有机溶剂,并且往往给常在LC尾巴的脂质带来更好的峰值形状。 权衡结果是,极性脂质,如强酸磷脂,可能需要高调器百分数,降低移动相的超临界性,部分降低SFC的优势。 尽管如此,柱状化学的最新发展已经减轻了这一限制。

方法制定方面的挑战和考虑

尽管具有优势,但用于脂质分析的SFC提出了某些挑战。超临界二氧化碳中极脂化合物的溶解性可能有限;经常需要丙酸铵或甲酸等添加剂来改进MS的峰值形状和电离化。选列是关键-选择的阶段会导致脂质类的共解。由于溴化阻燃剂设计和死体量的不同,仪器之间的方法转移可能很困难。实验室的保存时间标准化仍然落后于LC和GC,尽管最近的实验室间研究已开始解决这一问题。最后,高压泵系统的费用和专门培训的需要可能会妨碍较小的分析实验室的采用。

未来展望

接下来的SFC脂质分析创新浪潮可能侧重于几个领域。 首先,离子流动性分光仪(IMS)与SFC-MS的结合增加了基于碰撞截面的分离的额外层面,使得能解析色谱维度中共聚的异构脂质。第二,内直径为25-50微米的开 Tube(capillary)SFC柱,甚至有望更快分离和降低样本消耗。第三,开发便携式或外地可部署的SFC系统,也许可以使用低温-Cléx免二氧化碳生成,从而快速进行脂质测试,从而发现“clearchcare”或食品生产设施。第四,扩展保留时间数据库和机器学习-Xo驱动方法的优化将简化非专家用户的方法开发。随着监管接受程度的提高,SFC可能成为脂质药物和排出物药专著中的一种标准技术。

结论

超临界流体色谱学已经成熟,成为分析脂质和脂肪酸的强效高性能工具。 最近在探测器敏感性、柱子选择性和自动化方面的进展释放出从临床生物标记到食品真实性核查等各种应用。 尽管仪器标准化和方法转移方面仍然存在挑战,但不断开发的新定点阶段、连字符技术以及微型系统预示着一个充满希望的未来。 随着对更快、更绿色和更加翔实的脂质分析的需求不断增长,SFC完全有能力补充分析实验室中传统的GC和LC方法,在某些情况下还能够取代这些方法。