现代基因研究已经进入了由精确基因编辑工具开发驱动的变革时代。 在开创性技术中,TALENs(Trancific Actionator-Like Effector Nuclears)和ZFNs(Zinc Finger Nuclears)在CRISPR革命之前很久就已经成为了目标DNA修改的基础平台。 这些经过工程的蛋白质使得科学家可以在确定的基因组位置引入双弦断裂,利用细胞的内在修复路径——非同源端结合(NHEJ)或同源性定向修复(HDR)——实现基因的淘汰、校正或插入。 它们的影响贯穿医学、农业和基础生物学研究,在需要高特异性或小目标序列的情况下,它们仍然是不可或缺的应用。

了解技术、技术和革新网络和ZFN机制

锌指核释放:模态DNA识别

ZFN是第一个被广泛采纳的可编程核解,最早在1990年代中期描述. 每个ZFN由从锌指蛋白组组装的DNA绑定域和从]FokI[限制内分泌产生的DNA结晶域组成. 单个锌指模块一般都识别一个三核苷酸序列. 通过将多个手指连在一起,研究人员可以瞄准9到18个碱基对的序列. 因为 FokI必须进行二聚化以切除DNA,两个ZFN被设计成捆绑在目标地点的对面,这样它们的结晶域会聚集在一个空间区域之上. 异狄化的要求大大降低了离目标的活动.

锌指阵列的设计和组装在技术上可能具有挑战性,因为与上下文的亲缘关系——锌指的识别会受到相邻手指的影响。 尽管如此,OPEN(寡头聚泳池工程)和上下文依赖组装等方法提高了可预测性。 ZFN被用于创建灭细胞线,生成转基因动物模型,以及纠正早期临床试验中导致疾病突变。

转录激活器-类似效应器 核释放:单核苷酸特性

2009-2010年左右,TALENs作为一种设计规则更简单的替代品出现。 其DNA约束域来自复制活性反应器-类似效应器(TALEs ) , 植物病原体分泌的蛋白质]Xanthomonas[[]。 每个TALE模块都完全识别出一个核苷酸,由两个超可变氨酸残基确定 — — 称为重复变量grasisue(RVD ) — — 核苷酸配对。 最常见的RVD-核苷酸配对是耐丁烷的NI,细胞素的HD,胸腺素的NG,以及高特异性化的NNN。 通过排列这些模块,一个TALEN可以瞄准几乎所有DNA序列。

TALENs还使用FokI 裂缝域,并需要配对绑定才能剪切. TALE重复阵列的组装可以通过金门克隆或固相合成来实现. TALENs在细胞中一般表现出比ZFNs更高的特异性,毒性较低,尽管其大尺寸(~3kb每单体)可以限制病毒向量的传播. 尽管如此,它们已经成功应用于斑马鱼,大鼠,猪和人细胞线,以及一些临床前基因治疗研究中.

历史发展和里程碑

工程核解的旅程始于20世纪80年代末发现锌指蛋白. 1996年,钱德拉塞加兰和同事将一个三 ⁇ 津 ⁇ 指域融合到 FokI,创造了第一个ZFN. 这一突破使得在 Drosophila 和后来在人类细胞中进行目标基因编辑. 到2005年,ZFNs被用于修改 CCR5 基因,这个概念后来进入临床试验. SB ⁇ 728 ⁇ T试验(Sangamo Therapeutics)在病人的T细胞中用ZFNs来干扰 CCR5,显示了安全性和长期性]的植入.

在2007年TALE蛋白的结构解析后,TALEN技术迅速发展,在三年内,多个组群报告了用于酵母、植物和人类细胞基因编辑的功能TALEN。它们的简单降低了学术实验室采用基因组编辑的障碍,引发了一波发现。到2012年,TALEN被用于创建第一个基因编辑猪用于疾病模型和异种移植研究。金和金在中的综合审查“自然评论遗传学]详细介绍了这两种技术的平行演变。

现代研究中的应用

医学研究和基因治疗

ZFNs和TALENs对单致病性疾病有先进的基因治疗. 在镰状细胞病和β-地中海贫血中,ZFNs针对的是的BCL11A红外线增强器恢复胎儿血红素表达. 利用ZFNs编辑肝素干细胞的1/2期临床试验(NCT03282656)显示血红素持续改善. TALENs被用于纠正XQXXXXXXXXXXXXXXXX]病细胞中的基因ILG,其中纠正的细胞显示在老鼠模型中功能重组. 肿瘤释放物都用于治疗性抗原受体细胞,其持久性和耗尽性降低。例如,TALENXXXHLAXLAT 的治疗干扰[FLAT:7]PDLAT 分子。

农业生物技术

在作物改良方面,利用TALENs和ZFNs来生产耐草剂和耐病品种,第一个销售的TALEN-edited作物是Calyxt开发的,油料状况有所改善,于2019年释放;ZFNs通过淘汰谷物尺寸的负调节器来增加稻米产量,这些核素的高度特殊性减少了无意的基因组改变,这有利于规章的接受。 A Joung和Sander (2013)在 中详细分析自然生物技术[FLT] 审查了TALENs在植物基因组工程中的应用。

功能基因组学和模型生物

这两个平台都使得无法在胚胎干细胞的物种中进行系统的基因敲灭研究。在斑马鱼中,TALENs被用于在单一联合体中创建 > 200个目标变种,揭示发育和疾病的基因功能。在大鼠中,ZFNs干扰了p53肿瘤抑制器以创建癌症模型。通过HDR通过单斜角寡核苷酸捐赠者生成精确点突变的能力扩大了Mon ⁇ in模型的循环,用于神经退化和心血管疾病。研究人员还将TALENs与有条件的表达系统结合起来,以实现组织特定编辑。

与CRISPR*Cas9相比的优势和局限性

DNA的出现提供了更简单的设计、多功能和更高的效率,导致其被广泛采用。 然而,TALENs和ZFNs仍然具有独特的优势。它们的蛋白质DNA识别并不依赖于一个指南RNA,消除RNA在目标效应外的介导风险。此外,ZFNs和TALENs对重复或GC ⁇ rich区域对CRISPR目标的挑战序列表现出更高的特异性。 这些结构(~4–10 kb)的较大尺寸可以被包装成异异构病毒(AAV)载体,但双元器策略和微型 ⁇ TALEN的设计正在优化。

主要的限制因素是每个目标需要为新ZFN或TALEN进行工程的成本和劳动。虽然CRISPR只需要重新设计20 ⁇ bp导线序列,但ZFN和TALEN合成需要蛋白质域组装和验证。Off ⁇ bulate leavage也是一个问题;锌指阵列可以容忍不匹配,TALEN可以在部分目标地点切除。使用Guide-Seq或CIRCLE ⁇ Seq等方法的全面离目标剖面对临床翻译至关重要。 A 2017 年审查[ 对比了这三个核释放物的真伪性和交付情况。

未来方向和不断改进

目前的研究旨在提高TALENs和ZFNs的效率和安全性,同时降低生产成本。蛋白质工程的进步带来了ZFNs,提高了热稳定性,降低了细胞毒性。结构上对FokI变体(如ELDKKKR和Sharkey)进行指导重新设计,可以提高二聚化特性和催化活动。对于TALENs来说,机器学习算法现在预测了挑战性目标的RVD组合,高通量金门克隆可以单天制造数组。

输液仍然是体内应用的瓶颈。 Lipid纳米粒子和异性病毒相关载体正在精炼,用于肝脏干细胞和肝细胞。 瞬时输液的ZFN/TALEN蛋白(而不是DNA)会减少长期核释放表达和离目标事件。在农业中,TALEN用于开发无外国DNA的致病作物,这些天然环状物可能会因安全记录和市场批准先例而更受欢迎。

最后,TALENs或ZFNs与基础编辑或主编辑的结合——依靠镍酶而不是双 ⁇ 断裂的技术——可以扩大其效用,例如,Zn ⁇ finger ⁇ link cytidine deminase可以进行目标基转换而无需双 ⁇ 断裂。 有关基于ZFN的临床试验CCR5编辑(Tebas等人,2014年,[]新英格兰医学杂志 说明了继续推动在这些古典平台投资的治疗潜力。

最后,TALENs和ZFNs在基因研究工具箱中仍然至关重要。 它们独特的特性 — — 模块DNA识别、高度特殊性和既定的安全性 — — 使它们在某些应用中不可替代,特别是在RNA-X工具不合适时。 随着该领域向精确医学和可持续农业迈进,这些开创性的核释放物将继续催化改善人类健康和粮食安全的发现。