细胞和基因疗法的快速发展为以前难以解决的疾病,包括某些癌症、遗传失调和自体免疫条件,引入了变革性治疗方案。 然而,从实验室发现到商业规模生产的旅程仍然充满工程和生物障碍。 细胞和基因疗法制造中最具挑战性的阶段是下游加工 — — 一系列净化、集中和配方步骤,将原始生物材料转化为安全、有力和稳定的治疗产品。 最近的技术突破正在改变这一面貌,使制造商能够提高产品质量、减少污染风险,并转向可扩展、成本效率高的生产,为更广泛的病人服务。

了解细胞和基因治疗中的下游处理

细胞和基因疗法的下游加工包括细胞或病毒载体初始生产后发生的所有操作,与传统的生物学(如单克隆抗体)不同,CGT产品是活细胞或高度敏感的基因传导载体,如异性病毒(AAVs),扁豆病毒(badivius)或复录病毒。

  • 细胞采集和分离(如离心、过滤)
  • 细胞内产物的Lysis或释放(用于病毒病媒)
  • 碎片的澄清和清除
  • 使用色谱法进行纯化
  • 浓度和缓冲交换(例如微小的流滤)
  • 配制出品
  • 消毒或消毒填充
  • 质量控制测试和发布

每一步骤都必须优化,以最大限度地提高产量,同时满足严格的纯度、强性和安全监管要求。 任何阶段的损失都可能大大增加货物成本并限制患者的获取。 因此,正在大力推行改善恢复、缩短加工时间和消除人类干预的创新。

自动化和闭塞技术

下游处理对CGT的其中一个最重要的进步是转向自动化的封闭系统平台。 开放生物安全柜中的传统人工处理造成高度污染风险,且难以扩大规模。 封闭系统整合了无菌连接器、管焊机和自动液体处理,以在整个过程中保持消毒状态。 这些系统还减少了操作员的可变性,并能够实时收集数据。

机器人净化平台

能够进行多个下游步骤的机器人工作站——如离心、管道和柱式色谱仪——现在已可商业使用。 例如,ClinimACS Prodigy[系统(Miltenyi Biotec)可以自动进行细胞分离、激活和转接,而 Octane系统(Thermo Fisher Science)则提供了一个病毒载体净化的综合平台。 这些平台不仅减少了人工劳动,而且还提供了简化监管合规性的审计线索。

单用途和可处置部件

封闭式系统经常依赖单用途技术-袋、管装和滤波器-从而不需要清洗验证和减少交叉污染风险,转向单用途组件一直是多产品设施和灵活制造的主要促进因素,根据BioProcess International[审查,CGT生产中采用单用途系统的情况每年以两位数的速度增长。

色谱学和纯化方面的进展

净化病毒载体和治疗细胞仍然是最关键和技术上要求最高的下游步骤。 色谱介质和膜吸附剂的创新正在极大地提高选择性、能力和产量。

AAV和伦蒂维氏菌的全程色谱法

传统与异性相关病毒的净化方法(AAV)使用离子交换或大小排除色谱法,这些方法的分辨率和产品聚合度低,引入了专门绑定AAV血清型盖盖的亲和膜(例如AVB Sepharose, POROS CaptellSelect AAVX),使得单步捕捉的回收率大于90%,这些树脂现在被广泛采用,是不断改进的主题,例如工程胶囊能够容忍更广泛的pH和盐域. BMC生物技术 2022研究显示,基于新颖的亲和性结结结结结,在一次传中实现了AV9的95%纯度。

基于膜的色谱法

对于比AAV更大、更脆弱的扁豆矢量,传统的包装床色谱法可造成剪切损害和低恢复. Membrane吸附-多孔片或具有功能化表面的空心纤维-气流率较高,反压较低,减少了剪切压力.这些膜可以堆叠以提高容量,并经常用于流线模式,去除杂质,同时允许目标颗粒通过. FDA已经认识到膜色谱法是近期指导文件草案中病毒矢量净化的一种有希望的方法.

连续和多栏色谱

下游CGT正在出现连续处理方法,如模拟移动床(SMB)和定期反流色谱法(PCC),这些方法通过按序运行列来增加树脂利用率和减少缓冲消耗,例如,使用双柱式PCC进行AAV净化可以实现比《色谱法杂志》中报告的分批色谱法高三倍的生产率,然而,由于与分批上游过程的结合的复杂性,采用这些方法仍然有限。

处理可扩展性和成本问题

细胞和基因疗法的高昂成本 — — 通常超过每个病人100万美元 — — 在很大程度上是由昂贵的下游加工驱动的。 制造商现在正在优先考虑减少步骤数量、增加产量和降低消耗品成本的创新。

切变流过滤( TFF) 优化

TFF是用于浓度和缓冲交换的工作马。 近期的发展包括具有压力传感器的自动TFF滑动、流电表和软件控制以保持恒定的跨膜压力。这可以防止膜的扰动和减少过程时间。 此外,较新的TFF膜,如由蛋白质约束度低的多醚磺酮(PES)制成的膜,使病毒病媒的通量和恢复率提高了20~30%。

综合连续生物加工

连接多个单位业务的全集成连续下游列车——比如连续捕获步骤,然后是持续的病毒激活和抛光——正在被原型化。 这些“端对端”平台有望减少设施足迹和加工时间,从几周到几天。 美国国家制造生物制药创新研究所(NIIMBL)已经资助了几个项目,侧重于CGT下游工艺的横向整合。

法规和质量考虑

基因治疗产品中,美国食品和药物管理局和欧洲药品署等机构发布了关于化学、制造和控制(CMC)的具体指南。

  • 采用正交方法(如HPLC、质谱、感染性化验)对产品进行定性
  • 证明与过程有关的杂质(宿主细胞蛋白、残留DNA、助病毒)的许可
  • 病媒净化病毒鉴定研究
  • 关键质量属性在分批量内的一致性

过程分析技术(PAT)越来越多地用于实时监测下游步骤. pH,导电性和浊度的传感器,加上近红外光谱学,可以进行适应性控制和早期检测偏差. EMA鼓励在CGT制造中使用PAT,以促进质量逐一设计(QbD)方法.

病毒性激活和绝育

对多基因疗法而言,下游加工也必须保证冒险病毒的去除或失效。 低pH的孵化、溶剂/沉淀剂治疗和纳米过滤是标准方法,但每种方法都必须对特定产品进行验证。 最近关于热液纳米过滤器的工作使得病毒清除工作能够避免敏感病毒载体的衰竭,从而保持感染性。

未来方向和新兴技术

今后几年,若干尖端技术将进一步转变下游加工。

人工智能和机器学习

机器学习模型可以基于历史数据和分子性质来预测色谱阶梯的最佳操作条件(如盐梯度,pH值,流速),这些模型减少了对劳累经验优化的需求. MIT的研究人员开发了一个平台,利用强化学习推荐色谱方法进行AAV净化,在用户输入最少的情况下实现85%的产量.

利干德设计与蛋白质工程

小说亲和结膜的设计,如aptamers,DARPins,以及单域抗体,为靶向量或细胞亚型提供了超高特异性的可能性,这些结膜可以与各种支撑(resins,膜,磁珠)结合,并可能在单步中实现纯化.

实时发布测试

快速微生物检测方法,如qPCR,流体细胞测量,下一代测序等,融入下游线,最终可以实现产品的实时释放. FDA已经表示,如果检测结果与配方方法相当,愿意接受代用方法进行不育测试.

结论

细胞和基因疗法的下游加工正在发生深刻的转变。 自动化、封闭系统、先进的色谱介质和连续加工策略正在推动产量、纯度和一致性的提高。 这些进步对于降低制造成本和让更多患者获得救生疗法至关重要。 与此同时,监管框架正在适应这些创新,强调强力定性和过程验证的必要性。 投资于这些下一代下游技术的制造商将最有能力向诊所提供规模的细胞和基因疗法。