非侵入性监测在现代细胞文化中的关键作用

细胞培养仍然是生物医学研究、药物开发和生物制造的基石。 历史上,评估细胞健康和行为需要入侵性取样、污渍或物理干扰 — — 引入压力、风险污染和改变所研究生物体的方法。 非入侵性监测技术的出现解决了这些局限性,使得能够持续、实时地观察,而不会扰乱培养环境。 这一转变对于长期研究、高通量筛选以及制作敏感的生物记录,在保持不育和细胞完整性方面至关重要。

非侵入方法让研究人员能够捕捉细胞形态、代谢和生存的动态变化,同时保持培养的原生状态。 因此,这些方法不仅改善了数据质量,还减少了某些实验所需的动物数量,并与研究中的3Rs(重置、减少、改良)保持一致。 以下各节探讨了当今实验室中采用的最有希望的技术。

光学成像技术:不触摸的视觉

光学成像已经发展到远远超出了标准的亮域显微镜. 先进的无标签技术现在可以详细观察细胞结构和功能,而不用可能有毒或光裂的外源染料,其中相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位相位

相交和定量相交

相位相位相位显影将光通过细胞的相位移转换为强度变化,揭示细胞结构的细微细节. 量相成像(QPI) 的较近期发展提取细胞干质量,厚度,折射指数等数值数据,这使得研究人员可以实时监测生物量的积累而无需贴标签. 2021年的一项研究表明,在形态标志出现之前,QPI可以预测细胞分裂时间,并检测早期的动物变化小时(Sci Rep 11,8773).

与非侵入性探测物成像的荧光

虽然传统的荧光显微镜往往需要涂污,但较新的基因编码生物传感器(如对pH,钙或重氧化态敏感的荧光蛋白)可以由细胞本身表达. 这些传感器与自动活细胞成像系统结合后,不断报告细胞内状况,而无需外部干预. 例如,表达膜潜在敏感荧光蛋白的细胞可以被监测到电生变化,提供进入神经或心肌细胞活动的窗口而无需电极(PMC6287178).

电阻光谱:用其电气签名计算细胞

电阻光谱学(EIS)测量在细胞培养过程中对交替电流的反差。 粘合细胞起到绝缘作用,因此阻合变化与细胞数量、形态和附着质量直接相关。 这一技术是无损的,可以在多井板或微型生物反应器中实施,从而理想地进行高通量筛选。

实时单元格分析(RTCA)

xCELLigence平台等商业系统使用嵌入在微管板上的金电极来持续记录阻滞. 研究人员可以实时观察细胞粘附,扩散和细胞毒性. 常用的应用是药物毒性筛选:在细胞圆形和脱落时,添加化合物立即导致阻滞下降,提供了急性毒性的定量测量. EIS还足够敏感,足以检测受体激活或细胞骨骼重排引起的细胞形态的微妙变化(Sci Rep 12, 1569 ).

3D 文化和脚手架中的障碍

随着细胞培养向有机体和组织工程构造的方向发展,EIS已经适应了三维环境。 通过将微电极嵌入水凝胶或脚手架,研究人员可以监测细胞增殖和细胞外基质沉积,这几周来空间分辨率仍然有限,但跟踪生长的能力不会破坏,比破坏性的组织学有显著优势。

拉曼光谱:分子指纹无标签

拉曼光谱学利用单色光线的无弹性散射,生成细胞内分子联系的光谱指纹。 由于每个生物分子 — — 蛋白质、脂质、核酸、碳水化合物 — — 都有独特的拉曼特征,因此这一技术可以在单细胞层面识别生物化学变化,而不会有任何污点或基因改变。

元数据监测中的应用程序

光谱学用于跟踪干细胞分化、癌症进化和药物反应过程中的代谢变化。 例如,光谱峰值在750厘米-1(细胞色素c)信号激活电子运输链时增加,而2850厘米-1(CH2拉伸)区域的变化则表明脂质积累。 自动化光谱学系统现在可以在几分钟内扫描井板,生成高含量的培养基生化图(Nat Comun 13, 1560 )。

挑战和当前进展

拉曼散射本身就很弱,需要较长的获取时间或高激光力才能对细胞造成光损害。 类似一致的反斯托克斯拉曼散射(CARS)和刺激拉曼散射(SRS)等新方法通过几级数量增强信号,从而可以实现视频速率成像。 这些方法与机器学习分类器相结合,现在可以实时将细胞状态(活、人气、坏)分类,精确度大于95%。

新的新技术

暂停文化中的电光谱

虽然EIS对于粘附细胞是理想的,但二电光谱学(也称为电容测量)对于用于生物加工的酵母或CHO细胞等悬浮培养物是很好的。 通过应用射频电场,技术可以测量细胞膜的电容,这种电容与可行的生物量有线性的联系。 这在很多工业生物反应器中是实时控制喂养和采集的标准。

声波共振技术

超声波基方法(如声波共振光谱)通过介质发送低强度声波来探测细胞培养,声音和衰减的速度随细胞密度和聚集变化,虽然这些方法仍处于商业化的早期阶段,但提供了完全不接触和可扩展为大容量生物反应器的优势.

非侵入性办法的优点和局限性

  • 减少污染风险: 没有取样端口或入侵探测器意味着微生物的切入点较少.
  • 连续的数据流: 传感器可以每隔数周记录数据,揭示瞬间事件(如新陈代谢中的振荡),因端点分析而错过.
  • 细胞完整性的保护:细胞保持不扰动,允许平行的下游应用(例如为RNA测序而采集).
  • 增强生物洞察力: 动态测量可以区分细胞毒性和细胞静脉效应,也可以区分早死和晚死.
  • 限制:[ 一些技术,如拉曼光谱学,需要昂贵的仪器和精密的分析. 光学方法可能受到涡轮或不透明的介质(如高密度培养)的阻碍. 电气方法在高导介质中或细胞形成多层时效果较差.

与自动生物反应器和云平台的整合

当这些传感器被集成到自动生物反应系统时,非侵入性监测的真正潜力就得以实现。障碍探测器、Raman分光仪和自动显微镜可由一个中央软件控制,该软件可针对实时细胞数据调整环境参数(pH、温度、营养供应),这种闭路反馈可以使渗透和饲料批量战略能够最大限度地提高产量和一致性。许多销售商现在提供云连接平台,使研究人员能够通过仪表板远程监测文化,在超过预先确定的阈值时触发警报(Cyto SMART[)是具有云集成的商业活细胞成像系统的一个实例。

未来方向和挑战

虽然上述技术已经改变了研究工作流程,但在实现普及之前,仍存在若干障碍。 标准化是一个主要问题:每个仪器的输出格式不同,使跨平台比较变得困难。 美国国家标准和技术研究所(NIST)等组织正在努力为阻碍和拉曼测量制定参考材料。 数据解释 也需要专业知识;机器学习模型需要不同细胞类型和条件的培训以避免偏差。 最后,成本仍然是较小的实验室的一个障碍,尽管开放源硬件举措( OpenImpedance 正在使基本的EIS变得负担得起。

展望未来,非侵入性监测与微流体和芯片上的器官技术的趋同,预示着对细胞微观环境的空前控制。 嵌入微通道中的传感器可以追踪单个细胞的数日之久,将机械提示(耳压力、僵硬度)与生化反应联系起来。 随着计算功率的提高和传感器成本的下降,这些方法有可能成为任何细胞培养实验室的标准工具包。

结论

细胞培养的非侵入性监测不再是奢侈品,而是现代生物技术的必然。 相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相相