色谱学原理

色谱学根据分子在静态相和移动相之间的不同分布而分离. 静态相可以是固体或液体涂层在固体支撑上,而移动相则是通过系统携带样品的液体或气体. 化合物与静态相相互作用,通过吸附[],分化,离子交换,或大小排除,使其在不同时间发生增减. 这种分离力对于解决在元组学和生物标志发现中遇到的复杂的生物基团至关重要.

几个参数影响分离效率:柱尺寸,粒子尺寸[,流量率[,以及移动相间组 . 现代仪器使用高压来实现更快,更有效率的分离. 例如超高性能液体色谱仪(UHPLC)在超过15,000 psi的压力下运行,在保持高分辨率的同时缩短运行时间.

代谢组学的关键色谱技术

气相色谱法(GC)

GC对挥发和热稳定代谢产物来说是理想的。样品蒸发后通过一个带有液态静态的柱状涂层,以惰性气体(如氦)为移动相。 通常需要底质化来使极性代谢产物挥发 — — 常见试剂包括硅化剂和甲基化化合物。GC与质谱学(GC-MS)结合,提供了电离子化(EI)光谱,这些光谱极极极可跨仪器复制,从而能够基于库的识别。这使得GC-MS成为像氨基酸、脂肪酸和糖等初级代谢的无目标元体的标准平台。

液体色谱学(LC)

LC 处理 非挥发性 和 热活性 化合物. 许多元波组学研究使用 反相(RP) LC , C18列用于非极性到中极分子,或 氢相交色谱法 (HICI) 用于高极代谢物. Ultra-高性能液体色谱法 (UHPLC) 将颗粒体大小降低到2微米以下,并大幅提高分辨率和速度. LC-MS 带有电溅离子化 (ESI) 是现代元组学的功率,涵盖宽的化学空间.

毛细叶虫(CE)

CE在电场下狭长毛细管中根据它们的电离电离流动性分离离子,对高极性和充电代谢产物[]特别有效,如核苷酸,有机酸,和磷化化合物. CE-MS提供极佳的分离效率和低样品消耗,尽管其使用率低于LC或GC.

将色谱学与质谱学相结合

连字符技术 — — GC-MS、LC-MS、CE-MS — — 是元组学的支柱。色谱分离降低了离子抑制,使质谱仪能够单独分析化合物。 高分辨率质谱仪[[HTMS](例如Q-TOF、轨道喷射)提供了精确的质量测量,以进行自信的代谢物识别。Tandem质谱仪[MS/MS]通过分解模式产生结构信息。数据获取模式包括非目标剖面分析全扫描多反应监测,用于定向量化已知生物标志。

代谢组学工作流程

样本准备

适当的样品制备至关重要. 代谢物迅速翻转,所以代谢必须立刻 被抑制[(例如冷甲醇). 双脂液体-液体提取(例如甲醇/氯形态/水)等方法的分离,极性和非极性分量的分离,GC-MS的[] 脱氧化[] 蛋白降[ LC-MS的常见步骤. 增加内部标准以纠正矩阵效应和仪器漂移.

分离和检测

色谱条件根据兴趣的代谢物类别进行优化,例如,一个水/乙酰梯度和0.1%的甲酸的C18柱适合大多数脂质组学. HILIC柱对极性代谢物采用高有机含量移动相,柱温度,流速,注射量进行调整,以最大限度地提高峰值容量和再生性.

数据处理

原始色谱学-质量谱学数据经过]峰值检测[], 标本之间对齐, 正常化[,例如总离子计数或内部标准]。 XCMS、MZmine和化合物发现者等工具将这些步骤自动化。 统计分析[ –主要组成部分分析(PCA),部分最小方-差别分析(PLS-DA) –识别不同组别的新陈代谢。 注释使用数据库,如HMDB、METLIN和NIST。

代谢方法

非目标代谢组

非目标元素组学旨在在事先不知情的情况下检测尽可能多的代谢物. 全球剖面[ 生成关于代谢扰动的假说. 色谱学必须宽广或多列使用,例如双柱法(RP-LC和HILIC)既包括极性化合物也包括非极性化合物. 非目标数据是半定量的,需要仔细验证.

定向代谢组学

定向元波组学侧重于量化预定义的一组代谢物,常为生物标记物. 稳定同位素标签的内部标准[允许绝对量化. 三重四聚体仪器上的MRM能提供高敏感性和特异性. 色谱学对目标化合物进行优化,对高吞吐量往往有较短的运行时间.

色谱学在生物标志发现中的作用

发现阶段

在生物标志物发现中,色谱法将复杂的生物液体(血浆,尿液,组织提取物)分离,以揭示与疾病相关的代谢物. 例如, 支链氨基酸被确定为使用LC-MS的胰岛素抗药性的早期标记. 非目标研究比较组群,通过统计过滤将数百个候选特征减少到几十个.

验证阶段

具有希望的生物标记必须在更大的独立组群中验证。色谱学提供了验证所需的可复制性。保留时间稳定性和质量精确性确保一致性。 方法验证[包括评估线性、探测限度、精度和准确性。经验证的化验在临床翻译之前至关重要。

临床翻译

从研究向临床诊断的过渡需要强有力的高通量方法. Chromatography基于生物标记的测定方法,如homocysteine(LC-MS/MS)和vitamin D代谢产物[(LC-MS)],已经用于临床实验室. 自动化(例如在线SPE结合到LC-MS)减少了人工处理,增加了吞吐量.

疾病生物标志案例研究

癌症代谢学

癌症细胞表现出了改变的代谢 — — 沃堡效应(异氧甘油解 ) 。 色谱学使得乳酸升高、TCA周期中间体改变以及核糖体代谢的变化得以发现。 例如,[2]2-羟基葡萄糖[]是GC-MS检测到的IDH-mutant胶原中的一种喜剧品。 使用LC-MS的利皮派基因组学揭示了乳癌和前列腺癌中磷脂素的特征改变。

糖尿病和代谢综合征

代谢综合征涉及脂质、氨基酸和葡萄糖的脱节。色谱学研究已经确定[]BCAAs[、芳香氨酸[( ⁇ ,苯甲胺]],以及[]乳醇[]为2型糖尿病的预测剂。

神经病

阿尔茨海默氏、帕金森氏和ALS氏和异性激素在大脑和边缘都涉及到代谢功能障碍。 Lipidomics使用LC-MS揭示了脑脊髓液中的苯基皮和激素的变化。 (Polyamine levels (spermidine, putrescine)在阿尔茨海默氏被HILIC-MS检测到,这些化学方法有助于识别与认知下降相关的代谢物特征。

挑战和解决办法

矩阵效应和电离子抑制

共排化合物可以在MS中抑制离子化. 更好的色谱分辨率[ 减少共排. 使用[同位素标签的内部标准 补偿矩阵效应. 二维色谱法(LC×LC)或离线分解可以进一步清理样品.

数据可复制性

实验室间变异性仍然是一个障碍。 标准化协议[、质量控制样本,以及 跨实验室研究[(例如使用NIST SRM 1950) 提高了可复制性。保留时间索引使用[ 烷基lamine[ 或其他钙剂帮助将数据对齐。

大规模研究

人口级元波解需要处理数千个样本. 自动样制[(浪漫)和U(H)PLC带有短列[](例如5分钟梯度),可以实现高吞吐量. 批量校正算法(例如基于QC的校正)地址在长序上的漂移.

未来展望

高分辨率分离

柱技术的进步(例如 sub-2微米核心壳颗粒[]]和离子的移动光谱学[(IMS)]增加了一个基于碰撞截面的分离维度. LC-IMS-MS可以解决异构体并增加峰值容量. 综合性二维GC(GC×GC) 正在为挥发性元组学获得牵引力.

自动化和微型化

微流体装置和数字微流体正在开发用于芯片样品制备和分离. Automatical online SPE-LC-MS[系统减少人工步骤,增加再生产,这些技术将使色谱学更便于临床实验室使用.

与机器学习的整合

机器学习算法预测保存时间,帮助MS/MS光谱的代谢物注释,并在大数据集中识别规律. 将色谱学保留数据与质量光谱信息相结合,可以提高生物标记器识别的信心. 深层学习[模型也可以建议最佳分离条件.

结论

色谱学仍然是元体学和生物标志学发现不可或缺的工具。 从分离数千种代谢物到验证临床生物标志,色谱学技术提供了所需的分辨率、再生产性和定量精确度。 随着仪器的演化 — — 压力更大、柱子化学更强、离子流动性和自动化一体化 — — 色谱学将继续推动精密医学和代谢性环流方面的进展。 研究人员应当考虑每种技术(GC、LC、CE)的优点,并设计出在保持数据质量的同时最大限度地覆盖元体的工作流程。

进一步阅读,见 自然代谢物主题页, 线上线资源,以及最近 在生物标记器发现中审查LC-MS。 此外, 人类代谢物数据库提供了参考光谱和路径信息, 气象学工作区提供了公共数据集和分析工具。